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化繁为简!小翊带你轻松搞定qPCR数据分析。

上海翊圣生物科技有限公司2020年5月21日 10:02 点击:147

化繁为简!小翊带你轻松搞定qPCR数据分析

荧光定量PCRqPCR是实验室常用的一种大发3d,该大发3d可以应用于基因表达分析、基因分型、 病原体检测、SNP分析等。 qPCR实验操作简单,原理易懂,但面对一堆凌乱的数据,如何进行结果分析成了最头疼的问题,今天小翊将带你学会如何化繁为简,轻松获得可以发表SCI的数据!

qPCR常用的分析方法有相对定量和绝对定量,需根据不同的实验设计进行选择。本期我们关注的是qPCR最常见的应用—基因表达分析,一般选择相对定量法。

1. 实验设计

假设目前需要研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达的影响,以未经过任何处理的拟南芥植株作为对照组,实验组为经过一定光诱导处理过的植株,分别提取RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,选择拟南芥GAPDH基因作为内参,进行qPCR实验。

需要设置的qPCR孔如下:


 blob.png

 


1) NTC用来验证PCR体系中是否存在污染

2) NRT是指用未经反转录的RNA作为模板,是对gDNA残留的控制

3) 内参基因用来校正因样品初始浓度不同而造成的差异

4) 对照样品的选择一般有以下几种情况:

² 某处理方法对基因表达的影响,将未处理的样本作为参照样本;

² 检测基因在不同时间的表达差异,将0时刻的样本作为参照样本;

² 比较基因在不同组织中的表达差异,人为选定一个组织作为参照样本。

这里需要注意的一点是,上面每个材料设置了3PCR1、23,这是PCR重复,大发3d性重复,是为了消除操作误差,正确评估扩增效率。此外还需设置生物学重复,即不同的材料(时间、植株、批次、反应板)做的同一实验,目的是校准生物学误差,分析处理是否具有统计意义。具体到本例中,实验组和对照组都需要至少处理两组拟南芥样本(A、BC分别RNA进行逆转录,再做qPCR,统计时以三个生物学重复的平均值进行分析

2. 结果分析——△△Ct

△△Ct的特点是只依靠Ct值来计算结果,但前提是目的基因与内参基因的扩增效率较为一致并且都在90-110%之间。具体的计算公式为:

Ct= Ct(目的基因)- Ct(内参基因)

△△ Ct= Ct(实验组)Ct(对照组)

RQ=2^-△△Ct,RQ即为研究的目的基因在处理的样本中相比对照组的相对表达量。

假设上面研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中,qPCR的结果如下:


实验组(复孔Ct平均值)

对照组(复孔Ct平均值)

A

B

C

A

B

C

AtSUC2

23.60

23.00

23.15

25.80

26.32

27.00

GAPDH

16.75

16.80

16.72

16.75

16.50

16.00

△Ct

6.85

6.20

6.43

9.05

9.82

11.00

2^-△Ct

0.00867

0.01360

0.01160

0.00189

0.00111

0.00049





0.00116

2^-△△Ct

7.47285

11.72617

9.99814

1.62637

0.95373

0.42093

Ave

9.73238

1.00035

SEM

2.13907

0.60407

计算时,首先我们把对照组的2^-△Ct数据求平均值(上图中为0.00116),然后用2^-△Ct中的每一个数据除以这个平均值,即得到2^-△△Ct的值,最后再整理得到平均值与标准差,表明实验组目的基因表达量相比对照组提高了约9.73倍。结果用Graphpad软件作图如下:

blob.png 

利用软件的t检验计算出P value=0.0024<0.05表明具有统计学差异结果可信。

3. 结果分析——双标准曲线法

在实际应用中,由于目的基因与内参基因的扩增效率常常是不同的,需要重新设计引物,优化反应条件使得扩增效率相同,但其实我们还可以选择更方便的双标准曲线法

这里我们先了解下绝对定量的分析方法。具体的步骤是先通过PCR扩增目的片段,然后将目的片段插入克隆载体中,提取重组质粒,待测序正确后即可作为标准品。质粒DNA量可用Nanodrop等仪器测定,通过拷贝数换算公式转换成具体的质粒拷贝数,然后进行倍比稀释后扩增以标准品拷贝数的对数值为横坐标,以测得的Ct值为纵坐标绘制标准曲线,根据未知样品的Ct值就可以计算出其绝对拷贝数。

拷贝数计算公式:拷贝数=(质量÷相对分子质量)×6.02×1023

双标准曲线法是通过分别构建目的基因与内参基因的标准品,进行绝对定量并制作标准曲线,计算出未知样品绝对拷贝数之后再进行比较,因此准确性更高。

具体的计算公式为:

Q=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数

RQ=Q实验/Q对照

假设上面研究光诱导对拟南芥AtSUC2基因表达影响的实验中,分别构建AtSUC2GAPDH的标准品,制作标准曲线如下:

blob.pngblob.png 

待测样品目的基因和内参基因Ct如下:

 

 

 


实验组

对照组


A

B

C

A

B

C

AtSUC2

Ct

23.60

23.00

23.15

25.80

26.32

27.00

Copies

2238.72

2884.03

3083.19

466.34

321.88

198.15

GAPDH

Ct

16.75

16.80

16.72

16.75

16.50

16.00

Copies

218776.16

213796.21

223872.11

219785.99

260615.35

365594.79

Q

0.01023

0.01349

0.01377

0.00212

0.00124

0.00054





0.00130

RQ

7.87148

10.37664

10.59392

1.63214

0.95007

0.41692

Ave

9.61401

0.99971

SEM

1.51298

0.60913

计算时,首先将目的基因与内参基因的Ct值代入标准曲线的线性关系中,获得目的基因与内参基因分别在实验组和对照组中的绝对拷贝数,然后按公式Q=目的基因拷贝数/内参基因拷贝数,使得目的基因的表达量均一化。最后按公式RQ=Q实验/Q对照,计算出RQ= 9.71,表示目的基因在实验组的表达量比对照组上升9.71倍。

结果用Graphpad软件作图如下:

blob.png 

利用软件的t检验计算出P value=0.0008<0.05表明具有统计学差异结果可信。

本期的qPCR数据分析就到这里结束了,下面小翊为你推荐一波优质产品,让你的实验数据更加准确可靠,快来pick吧!

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

促销价(元)

Hifair® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus)

11141ES60

100 T

1383

798

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )

11201ES08

5 mL

740

498

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (Low Rox Plus) 

11202ES08

5 mL

740

498

Hifair® qPCR SYBR® Green Master Mix (High Rox Plus) 

11203ES08

5 mL

740

498

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)

11195ES08

5 mL

1653

663

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,Low Rox)

11196ES08

5 mL

1653

663

Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,High Rox)

11197ES08

5 mL

1653

663

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,No Rox)

11198ES08

5 mL

1466

586

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,Low Rox)

11199ES08

5 mL

1466

586

Hieff UNICON® qPCR SYBR Green Master Mix ( 抗体法,High Rox)

11200ES08

5 mL

1466

586

 


(来源: 上海翊圣生物科技有限公司 )

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