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双荧光素酶报告基因检测数据集

上海翊圣生物科技有限公司2020年3月16日 9:00 点击:88

双荧光素酶报告基因检测数据集

双荧光素酶报告基因检测系统因其具有灵敏度高、无细胞内源性表达干扰等优势,现已被广泛用于基因表达调控的研究中。该系统包括萤火虫荧光素酶Firefly luciferase)和海肾荧光素酶Renilla luciferase),通过和底物的相互作用检测基因的表达。通常海肾荧光素酶相对更多地被用作转染效率的内参,以消除细胞数量和转染效率的差异,实验结果为萤火虫荧光素酶的荧光值和海肾荧光素酶的荧光值的比值。

双报告检测方法的应用十分广泛,如调控元件功能研究、转录因子研究、信号转导通路、miRNA调控等。通常把靶基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游,与海肾TK载体共转染至细胞中,以研究启动子的强弱或转录因子对启动子的作用;或把3’-UTR区克隆在luciferase的下游,以研究miRNA对目的基因的调控作用。

该试剂盒主要应用于动物细胞中,当然也有很多小伙伴用于植物中,小翊这边收集到了一些原始数据与大家分享。在这里分成动物细胞植物两个part。以下案例均使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒完成(Yeasen,CAT:11402)。

PartⅠ 动物细胞篇

1、验证鞘磷脂代谢中关键酶A的活性是否受关注基因X的影响

实验方案:在293T、Caco-2和HIEC-6三种细胞中进行验证。将A酶基因启动子连接在Luc上,Luc-A、

Ren载体和X基因的过表达载体(空载作为对照)共转染,通过promega_ GloMax Multi Plus酶标仪进行检测。

实验结果:


293T

Caco-2

HIEC-6


Con

Mars

Con

Mars

Con

Mars

Luc

79804

16397

3305

2160

1215

599

Ren

132550

19912

57334

32021

11629

4694

Ratio

0.609

0.856

0.058

0.070

0.104

0.128

 

 

1584361746(1).jpg


 

实验结论:从图中结果可以看出,基因X过表达可以提高A酶活性,证明基因参与调节鞘磷脂代谢

2验证cGAS150蛋白在293T里是否能激活干扰素通路。

实验方案:构建IFN-β-Luc质粒,将其与Ren载体、cGAS150过表达载体共转染293T细胞。使用Promega GLOMAX 20/20LUMINOMETER酶标仪进行后续检测。

实验结果:


Luc

IFN-β-Luc

cGAS150

Luc

240361

1028794

82

904819

Ren

50899

87816

693114

Ratio

4.69

11.73

175.63

 

1584361986(1).jpg


实验结论:cGAS150蛋白可激活干扰素通路。

3、Poly(I:C)是双链RNA的类似物,是一种干扰素的诱导剂。验证其对干扰素X的调控作用。

实验方案:构建IFN-1-Luc载体,将其与Ren载体共转染EPC细胞,给予Poly(I:C)处理24h。使用Promega;E5311酶标仪进行检测。

实验结果:


IFN-1-Luc

IFN-1-Luc+Poly(I:C)

Luc

57451

1023987

Ren

11690

15500

Ratio

4.91

65.02


1584362079.jpg

实验结论:Poly(I:C)会诱导IFN-1的表达。

4验证小鼠miR-1与靶基因3’UTR是否发生作用并进一步确定miR-1与靶基因3’UTR的作用位点。

实验方案:构建Luc-3UTR-WT载体和Luc-3UTR-mut载体,分别将它们与mimic NC/mimic miR共转染293T细胞。使用Promega酶标仪进行检测。


WT+mimic NC

WT+mimic miR

Mut+mimic NC

Mut+mimic miR

Luc

 182884

36516

177619

170722

Ren

  30279

32452

32489

30576

Radio

   6.08

1.11

5.47

5.58

实验结果:

 

1584362165(1).jpg


 

实验结论:miR-1的作用靶点是 3’UTR

5、验证转录因子NRF1的野生型以及突变体形式对于其靶基因A的启动子序列的调控作用,比较NRF1野生型以及突变体的转录活性差异。

注:PGC-1α作为核转录辅助因子,可辅助NRF-1的转录调控,在一定程度上增加NRF-1的活性。A则是被PGC-1αNRF-1共同作用转录激活后转运至线粒体。研究发现,NRF-1通过与A基因启动区反应原件结合,刺激A基因的转录。

实验方案:构建Luc-A载体,NRF1 WT/mut表达载体,PGC-1α表达载体,将它们共转染至HEK293T细胞。使用Promega 9100-102(421)酶标仪进行检测。

实验结果:


vector

PGC-1a

NRF1 WT+PGC1a

NRF1 WT+PGC1a

NRF1 mut1+PGC1a

NRF1 WT+PGC1a

NRF1 mut2+PGC1a

Luc

112317

91710

1453678

1618954

1577119

1890584

1700605

Ren

57429

45074

252462

256203

296715

317458

326011

Ratio

1.96

2.03

5.76

6.32

5.32

5.96

5.22


NRF1 WT+PGC1a

NRF1 mut3+PGC1a

NRF1 WT+PGC1a

NRF1 mut4+PGC1a

NRF1 WT+PGC1a

NRF1 mut5+PGC1a


Luc

2058569

1955671

2264558

1867001

2363028

1973545


Ren

356474

355662

351878

356324

365557

354973


Ratio

5.77

5.50

6.44

5.24

6.46

5.56



1584362237(1).jpg


 

实验结论:NRF11,24,5号突变体对其转录活性有抑制作用。

6、验证小分子化合物9-cis-RAsigma是否为RXR的激动剂。

实验方案: 构建pBind-RXR α-LBD载体, 将其与 pG5 质粒共转染293T细胞,同时用不同浓度的9-cis-RAsigma处理细胞。使用GloMax® Discover Microplate Reader_GM3000酶标仪进行检测。

实验结果:


con

9-Cis-low

9-Cis-high

Luc

1193

3952

44087

Ren

7815

5609

7045

Ratio

0.15

0.70

6.26


1584362384(1).jpg


实验结论:9-Cis-RA是RXR的激动剂,与文献报道的相一致。

7、验证IRF3转录因子与IFN-β启动子的相互作用。

实验方案: 构建Luc-IFN-β载体,将其与IRF3表达载体、Ren载体共转染HEK293T细胞。使用SpectraMax  L酶标仪进行检测。

实验结果:


Luc-IFN-β+pRL-TK

Luc-IFN-β+pRL-TK+IRF3

Luc

69576

462790

Ren

456979

16248

Ratio

0.15

26.14

 


1584362468(1).jpg


实验结论:转录因子IRF3IFN-β启动子正调控作用

8验证miR-375A基因 3’UTR是否结合从而抑制A基因的表达。

实验方案:分别构建Luc-3UTR-WT载体和Luc-3UTR-mut载体。将它们与mimic NC/mimic miR共转染MCF-7细胞。使用POLARstar Omega酶标仪进行检测。

实验结果:


WT+mimic-miR

mut+mimic-miR

WT+mimic NC

Luc

1430

914

650

Ren

41251

8206

5979

Ratio

0.041

0.11

0.10


1584362555(1).jpg

实验结论:3UTR-WT是miR-375的作用靶点。

9、验证靶基因基因组中的部分基因片段是否发生作用并进一步确定这些基因与靶基因的作用位点。

实验方案:构建pGL-3 pro-Gene载体及Target gene表达载体,将它们与Ren载体共转染至293T细胞中。通过BERTHOLD centro XS3 LB 900酶标仪进行检测。

实验结果:


Target gene


Gene1

Gene2

Gene3

Gene4

Gene5

pGL-3 pro-control

Luc

336072

634822

512443

153988

825272

1070842

Ren

464031

391284

417179

676539

572861

738308

Ratio

0.72

1.62

1.23

0.24

1.44

1.46

1584362733(1).jpg 

实验结论:Target gene对Gene 1,4具有明显的负向调控作用。

PartⅡ 植物篇

1、验证在Y1H筛选后的6个不同转录因子,对目标基因的调控作用。

实验方案:构建Luc-目标基因启动子载体和TF表达载体,将它们与Ren载体转化至拟南芥的原生质体中。通过MiKro Win2000酶标仪进行检测。

实验结果:


Con

TF1

TF2

TF3

TF4

TF5

TF6

Luc

305

972

914

1519

446

400

299

Ren

179498

57786

53551

113107

51685

56714

491297

Ratio

0.002

0.017

0.018

0.014

0.009

0.007

0.001

1584363065(1).jpg 

实验结论:TF1-5对目标基因上调,而TF6对目标基因起抑制作用。Luc数值偏低,可以调整质粒的转化比例、提高原生质体和底物的使用量)

2、验证预测的3个拟转录因子对目标基因的调控作用。

实验方案:构建Luc-目的基因启动子载体和TF表达载体,将它们与Ren载体转化至拟南芥的原生质体中。通过MiKro Win2000酶标仪进行检测。

实验结果:


Con

DE4

GA16

TX2

Luc

621

177

2583

141

Ren

111199

282269

26308

97342

Ratio

0.006

0.001

0.099

0.002

 

1584363136(1).jpg 

实验结论:GA16对目的基因起正向调控作用;DE4和TX2起负向调控作用。(Luc数值偏低,建议见上述案例

3、采用烟草叶片瞬时表达的方法检测TF在体内的转录活性。

实验方案:报告载体含有5× GAL4激活域,其下游连接 Luc 基因;效应载体含有TF基因,其上游连接GAL4 DNA结合结构域,形成融合转录因子。将两种载体转化至农杆菌,侵染烟草叶片。侵染24-36h后,将叶片打孔成1.5cm左右的叶盘。在2mL的EP管中放入3片左右的叶盘,加入液氮,放入预冷的小钢珠进行研磨。加入裂解液,使用 SoftMax Pro Software(Molecular devices)酶标仪进行检测。


1584363406(1).jpg


实验结果:


pBD

pBD-VP16

pBD-TF

Luc

18833

7291

50667

Ren

14333

3855

12012

Ratio

1.33

1.91

4.30 


1584363260(1).jpg


实验结论:烟草双荧光素酶检测结果显示,含有pBD-TF效应载体的荧光值显著高于阴性对照pBD阳性对照(pBD-VP16)荧光值。结果表明TF是活性很高的转录激活因子。

4、验证转录因子X能否结合到基因AB的启动子区域从而激活其表达

实验方案:构建Luc-A/BTFX表达载体。将它们共转化至农杆菌中,侵染烟草叶片。2天后,将叶片打孔成1cm左右的叶盘。取3片放入2mL EP管中,加入液氮进行研磨。之后加入裂解液进行处理。用Mithras(LB940)酶标仪进行测定。

实验结果:


A-Con

A-TFX

B-Con

B-TFX

Luc

386

397

373

411

Ren

1493602

1290175

25508

7345

Ratio

0.00026

0.00032

0.01507

0.05708


1584363493(1).jpg


实验结论: 转录因子X能结合到基因B的启动子区域并激活其表达(p<0.005但是无法结合到基因A的启动子区域。Luc数值偏低,要确保研磨彻底,加大裂解液的使用量)

 

以上就是小翊收集到的双荧光素酶相关数据了,希望对您有帮助。

 

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(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


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