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Uracil DNA Glycosylase, Heat-Labile高效预防PCR气溶胶污染 ——

上海翊圣生物科技有限公司2020年3月12日 9:34 点击:177

Uracil DNA Glycosylase, Heat-Labile高效预防PCR气溶胶污染

——酶活高效,活性可控

操作环境中的气溶胶污染是造成PCR结果假阳性最常见的因素。美国科学家Lindahl最早在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中发现了UDGUracil DNA Glycosylase,尿嘧啶DNA糖基化酶),利用UDG选择性水解含dUDNA单链或DNA双链的机制,巧妙地引入dUTP取代PCR体系中的dTTP而构成了dUTP/UDG酶防污染系统。稳定使用该系统, 可有效消除PCR体系中混入的扩增残留污染物(多以气溶胶形式存在),保证扩增结果的准确性。

作用原理

dUTP/UDG酶是作为PCR反应体系的配制成分发挥防污染作用的。作用原理是dUTP使得每个扩增反应生成的PCR产物成为含有dUDNA链。为防止此前积累的残留产物作为模板干扰扩增反应,在新扩增反应体系进行时,一定温度下,UDG酶选择性的催化水解dU-DNA链中的尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架的N-糖苷键,释放出游离的尿嘧啶,形成有缺失碱基的DNA链。经95℃高温进一步水解断裂,从而消除污染。同时高温使得UDG酶失去活性,不会水解新的dU-DNA见图1

天然的、未经修饰的DNA不含dU,不受UDG酶影响,继续作为PCR/qPCR扩增的模板进行扩增。

1584019950(1).jpg


产品特性

Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile是来源于嗜冷海洋细菌经大肠杆菌表达纯化的重组蛋白,在25-37发挥活性,热敏感,50℃ 10 min95℃ 2 min即发生不可逆灭活。可与热启动Taq酶搭配使用,保证扩增的特异性。

10 U本品经E.coli 16S rDNA特异性的TaqMan qPCR检测,E.coli基因组残留低于10拷贝。

无核酸内外切酶和RNase残留。

尿嘧啶是此酶识别的唯一碱基。

dUTP/UDG酶防污染系统使用方法(仅供参考)

1. 根据实验需要dUTP终浓度可在0.2-0.6 mM 之间调整并选择性掺入0.2 mM dTTP

2. 体系中添加UDG酶,添加量1 个单位足矣1单位可以30min消化1μg dU-DNA

3. PCR反应程序前加上25℃-37 2-10min的保温步骤活化UDG酶活性。

4. 正常进行后续PCR程序。

效果展示

1584019806(1).jpg 

2. 0.05U0.025U0.0125U0.00625U0.003125U 热敏UDG360ng 200bp dU-DNA25℃孵育30min952min灭活)。电泳检测热敏UDG酶的降解效果,可以看出0.025U的热敏UDG可完全消化dU-DNA

应用场景

气溶胶是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系,在气体与液体面摩擦时(如在涡旋振荡后未离心直接开盖,移液枪反复吹吸样品、PCR结束后开盖等)易形成。在分子实验室中,因频繁进行上述操作,并长期进行某些特定基因的扩增易出现气溶胶污染。

PCR是一种指数扩增微量基因片段的核酸检测大发3d,灵敏度极高。PCR反应体系中极微量的污染物即可引起假阳性结果。因反应成分多样,若体系中存在气溶胶污染物,假阳性的原因不易排查,也很难解决。

dUTP/UDG酶防污染系统可最大程度的保证PCRqPCRRT-qPCRRPA等核酸检测结果的准确性。

除此之外,该系统还可用于定点突变克隆、二代测序文库构建等实验。

FAQ

Q1: UDG酶可以用于已存在的扩增产物气溶胶污染吗?
A: 已存在的扩增产物气溶胶污染不含dU,此时UDG酶不能发挥作用。建议选取其他扩增区域,重新设计引物,并建立dUTP/UDG酶防污染系统,即可避免“未来”的气溶胶污染。

Q2: dUTP会影响扩增产物的dU-DNA在杂交测序克隆和酶切等方面的下游应用吗

A:含dUPCR产物可正常进行核酸杂交和测序效果与常规PCR产物无差别。在分子克隆实验中连接产物需使用UDG酶缺失的感受态细胞进行转化和质粒扩增。酶切实验中,已证实EcoRIBamHI不受dU影响,但HindIII酶切效率有所降低,更多内切酶效果还需自行尝试。

Q3: dUPCR产物后续做了连接和转化,无克隆,这是什么原因?

A: 需要特别注意在分子克隆实验中连接产物需使用UDG酶缺失的感受态细胞进行转化和后续的质粒扩增。

Q4: UDG用于RT-qPCRRT-PCR体系时,会干扰逆转录实验吗?
A: 可选用耐受性能良好的逆转录酶,如Hifair III Reverse Transcriptase最佳作用温度50-55℃,此时热敏UDG酶活性极低。

Q5: UDG酶会切割RNA吗?

A: 不会。在生物体内,UDG酶在DNA修复过程中发挥重要作用。它可以修复dC脱氨基形成dU的突变,进而避免GC碱基对突变为AT碱基对的可能。

Q6: UDG酶反应Buffer是什么

A:UDG酶可以在各类缓冲液中发挥作用,如常规的TaqBuffer、连接酶Buffer、酶切Buffer

Q7: UDG酶对DNA链的碱基个数有要求吗?

A: 不能从6碱基或更少的寡核苷酸上水解尿嘧啶。

产品订购

产品名称

货号

规格

价格(元)

Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile 热敏UDG

10303ES60 

100U

683.00

Uracil DNA Glycosylase (UDG), Heat-Labile 热敏UDG

10303ES76

500U

3083.00

Uracil DNA Glycosylase (UDG)

10304ES60 

100U

582.00

Uracil DNA Glycosylase (UDG)

10304ES76

500U

2782.00

dUTP, 100mM Solution 脱氧尿苷三磷酸溶液(100 mM

10128ES72

250μl

253.00

dUTP, 100mM Solution 脱氧尿苷三磷酸溶液(100 mM

10128ES80

1ml

853.00

注:上述产品库存长期均保留有多个批次以备测试。

产品支持:400-6111-883

HB200308


(来源: 上海翊圣生物科技有限公司


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