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循环再入波促进自组织组织环中hiPSC来源心肌细胞成熟

世联博研(北京)科技有限公司2020年3月20日 2:58 点击:621

循环折返波促进自组织组织环中hiPSC衍生的心肌细胞的成熟


定向分化方法可以获取从人诱导多能干细胞(hiPSC)分化出的高纯度心肌细胞;然而,它们的不成熟特性限制了它们在药物筛选和再生疗法中的应用。心肌细胞的快速起搏已用于有效促进心肌细胞的成熟,在这里我们描述了一种改良的培养板中的简单大发3d,hiPSC衍生的心肌细胞可以在其上形成三维自组织组织环(SOTR)。使用钙成像,我们显示在环内,动作电位的折返波(ReWs)自发产生,并以高达4 Hz的频率强劲运行。2周后,具有ReWs的SOTRs表现出更高的成熟度,包括结构组织,心脏特异性基因表达增加,Ca增强2+处理性能,增加的耗氧率和增强的收缩力。随后,我们使用数学模型来解释SOW中ReW的起源,传播和长期行为。

介绍

尽管有人提出将人诱导的多能干细胞(hiPSC)作为组织工程,药物筛选和再生医学应用的丰富资源1,但它们具有与成年人心肌细胞不同的特征,包括不成熟的肌节结构和形态,胎儿样基因的表达谱,和Ca不足2+ -处理特性234hiPSC衍生的心肌细胞的不成熟特性可能会阻碍其对成人心脏生理的反映,以进行疾病建模和药物评估。

为了实现更高程度的hiPSC衍生的心肌细胞成熟和功能的,各种方法已经被开发,包括动态培养5,三维(3D)工程化的心脏组织678,3D印刷9,另外的因素10,细胞外基质1011,和外部刺激。电刺激,尤其是高频起搏,早已被建议作为成熟肌细胞的一种有效方法312131415,其上调心脏标志物131416,提高的Ca 2+ -处理特性 3,并促进心肌细胞排列 17在此过程中,需要适当的刺激方案以最小化可能的组织损伤 18此外,它仍然具有挑战性快速步伐心肌组织(≥2赫兹)在长时间 19由于可能产生的副作用,如重金属中毒,电解,pH变化,和活性氧(ROS)的生成 2021此外,为了刺激大众而进行升级是困难的或需要高水平的功耗 19作为一个重要的补充,机械刺激可促进心肌细胞的成熟,用由能够迫使肌细胞组装成结构和功能上对齐3D合胞体的外部拉伸装置施加周期性机械应力22,从而影响它们的基因表达232425和Ca 2 +骑车26

在另一方面,螺旋波[重入波(REWS)]心脏组织内一直被研究作为心律失常研究的模型2728293031,和体内螺旋波所造成的快速打浆能导致心脏功能障碍,甚至导致患者死亡。但是,在体外条件下使用时,类似于快速电刺激14一样由螺旋波引起的快速跳动可能有益于心肌细胞的成熟。

在这项研究中,我们创建了一个平台,该平台能够促进hiPSC衍生的心肌细胞快速形成3D自组织组织环(SOTR),其中ReW形式的动作电位的传播可以自发产生并在闭环周围传播循环,从而使心肌细胞在不受到任何外部刺激的情况下连续且稳健地以高频率(约2-4 Hz)跳动长达89天以上。此外,我们发现可以通过更改环的直径来调整拍打频率和ReW速度。此外,为了阐明ReWs的起源,传播和长期行为,我们构建了一个数学模型,该模型最终与实验数据非常吻合。培养2周后,带有ReW的SOTR证明了结构组织的改善,2+处理性能,增加的耗氧率(OCR)和增强的收缩力。据我们所知,我们的结果证明了一种自发性心肌细胞成熟的新方法,并且可以作为将来生产成熟的hiPSC来源的心肌细胞的经济实用的系统。

结果

hiPSC衍生的心肌细胞环的自组织

我们通过将hiPSC来源的心肌细胞涂在培养皿中,培养皿的中央有一个柱子来创建3D SOTR,在2天之内心肌细胞聚集并形成厚的组织环(第2天为432.72±56.18 µm,图  1a–c和补充图  1)。如遗传编码的钙指示剂GCaMP3所示,我们在SOTR(即ReW;补充电影1)中发现了环状激活传播  ,其中一个SOTR中存在零至两个ReW(图  1d,e和补充电影  2)。除了圆形几何图形外,还测试了其他几何图形,例如4点星形,5点星形(补充图  2a)。),也可以获得矩形和圆形之间的几何形状。但是,在这些模板的不同区域中组织的形成均不如圆形几何形状中的组织均匀。另外,圆环组织更均等和稳定地组织,同时保持较高的ReWs(补充图  2b)。因此,我们选择了圆环来改造心脏组织。荧光激活细胞分选(FACS)(补充图  1b),电压染料染色和免疫染色数据表明,SOTRs主要是心室心肌细胞,很少有成纤维细胞(补充图  34)。

图1:ReW促进了SOTR中细胞的快速跳动。
图1

描述SOTR形成示意图。b模板中hiPSC衍生的心肌细胞的明场图像。红色箭头指示模板中心脏组织的边缘,虚线分别指示PDMS块和支柱边界。支柱直径= 3毫米。比例尺代表800 µm。c在指定的培养日对SOTR的宽度进行定量(平均值±标准差;n  = 4个生物学独立的样品)。** P  <0.001(方差分析)。d具有零,一或两个ReW的GCaMP3阳性SOTR的激活图。红色箭头指示动作电位的传播方向。Ë在SOTRs与零个,一个,或第6天2个REWS在环上的固定位置GCaMP3荧光信号˚F在不同培养时间的SOTRs节拍速率(平均值±SD; 2个REWS:Ñ  = 10; 1 REW:Ñ  = 12; 0 ReW:n  = 8个生物学独立的样本)。P  <0.05;** P  <0.001(方差分析)。g培养14天后,SOTR中自发跳动的波速为零,一或两个ReW;对于ReW组,在停止ReW并恢复自发搏动后记录速度(平均值±sd; 2 ReW:n  = 4; 1 ReW:n  = 4; 0 ReW:n  = 6个生物学独立的样本)。*P  <0.05(方差分析)。h在第6天(n  = 204个生物学独立的样本)和14天(n  = 186个生物学独立的样本),不同数量ReW的发生百分比

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跟踪记录(图  1d,e)表明连续ReW之间没有较长的休息时间,从而导致能够维持更多ReW的SOTR的跳动率更高(图  1e,f)。ReW为零的SOTR的自发搏动率在第6天为0.21±0.10 Hz,并在2周内保持稳定,而第6天有一或两个ReW的SOTR的自发搏动率要高得多(2.40±0.49和3.30±0.39 Hz,分别)。值得注意的是,ReW组的波速(〜2 cm s -1远低于自发性跳动组(0 ReW; 5.93±1.50 cm s -1)。相对于零ReW组(补充图5和补充电影  3),ReW组中较高的跳动频率可能是由于速度较慢,起搏间隔和不应期缩短而引起的  ,这是一致的。与兴奋媒体相关联的以前的报告3233343536此外,在ReW停止后,两个ReW组的自发搏动速度显着提高(p  = 0.01),超过10 cm s -1(图  1g)。

在培养的2周中,一个和两个ReW组的跳动率略有增加,在第14天分别达到3.03±0.68和3.92±0.69 Hz。经过6天的培养期后,204个SOTR中有83.8%具有一两个ReW,14.2%具有零ReW,2%具有三个ReW。然而,培养2周后,这些百分比改变为28.5%(零ReW),48.9%(一ReW),22.6%(两ReW)和无SOTR(三ReW)(图  1h)。噪声和干扰(例如介质更换期间的噪声和干扰)可能会引起ReW的变化和/或消失。在长期文化中,我们发现ReW可以在SOTR中维持> 89天(补充图  6)。)。除了静态培养外,还应用了旋转振荡器上SOTR的动态培养来检查对ReWs的影响。在培养过程中,我们确实发现使用ReWs可改善环中心肌细胞的跳动频率(补充图  7),该频率在第6天从3.30±0.39显着提高到3.89±0.18 Hz(p  = 0.038)和从3.92±第14天时为0.69至5.57±0.06 Hz(p  = 0.001)。先前有报道,较高的跳动频率与心肌细胞的较高成熟有关14另一方面,在有或没有旋转培养的情况下,零个ReW组之间没有显着差异。这些数据表明,动态培养可以改善ReW组5心肌细胞的氧气和葡萄糖的利用率尽管有所改善,但我们还发现动态组的ReW发生率在第6天降至50%,在第14天降至40%。ReW的消失可能是由于动态介质流引起的扰动。为了改善培养孔的设计并减少培养基的干扰,有必要进行更多的未来研究工作。

为了根据它们的组织,传播和长时间行为更好地理解这些ReW的性质,我们构建了一个数学模型(补充信息和补充图8),该模型  包含一个细胞环,每个细胞环可以以固有频率自发搏动。模型中每个环中的单元总数与环的直径成正比。通过间隙连接的相邻小区之间的耦合3738随着时间逐渐增加,以模拟SOTR的自组织和形成过程。最初,所有单元都独立设置为随机跳动阶段,所有单元都独立跳动。随着间隙连接的形成和加强,一个单元的跳动具有在其相邻单元中触发跳动的可能性增加,从而形成传播波。最初,这些波不同步且短暂,因为它们开始,消失,有时会相遇并碰撞(补充电影  4)。随着时间的流逝,SOTR留下了一个主要的传播波模式,该模式包含零个或多个ReW(图  2a和补充电影  4),该过程类似于我们在实验结果(补充电影)中观察到的过程。 5)。值得注意的是,具有一个或两个ReW的SOTR占了大多数模拟样本,在我们的实验结果中也观察到了这种趋势(图  2b)。

图2:使用数学模型在SOTR中准确再现ReW特征。
图2

a模型(上图)和激活图(下图)的模拟结果示例。对于ReW为零的组,一个动作电位从环的左位置开始,并沿环以相反的方向传播,此后两个波相遇并an灭。该过程再次以周期性地在同一位置发起新的波浪开始。对于具有一个,两个或三个ReW的组,稳定的ReW绕环行进。膜电位和激活时间用颜色编码。b在第6天,SOTR中稳定ReW的百分比(直径= 3毫米; 模拟中n = 60, 实验中n = 204个生物学独立的样品)。c拍频(Hz)和dSOTR的ReW速度在第6天有一个ReW,用于不同直径的柱子[实验:1-mm SOTR(n  = 4);3毫米SOTR(n  = 12);5毫米SOTR(n  = 10个生物学独立的样本)]。** P  <0.001(方差分析)。e柱直径为3 mm的SOTR的ReW速度为1、2或3 [实验:平均值±sd;3个ReW(n  = 4);2个ReW(n  = 10); 1 ReW(n  = 12个生物学独立的样本)。P  <0.05;** P  <0.001(方差分析)。f不同柱直径的SOTR中的最大ReW数。

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然后,我们在数学模型和实验中研究了ReW的特征和特性如何受到诸如环直径等特征的影响。SOTR中细胞的跳动频率随环直径的增加而降低,如图2c中的一个ReW所示  我们注意到恒定的ReW速度意味着随着环直径(与环周长成正比),跳动频率呈线性下降,并且周长越大,波浪将花费更多的时间绕其传播。但是,图2c中的数据  显示出比线性下降更慢的趋势。因此,我们测量了波速,发现它在模拟和实验中都沿着环直径增加(图  2d)。如补充信息中所述,这是由于单个hiPSC来源的心肌细胞自发搏动的能力所致。较大环中的单元将等待更长的时间以等待下一个ReW到达,从而使它们更容易被波前激活并导致更快的波速。这种洞察力使我们能够预测两个和三个ReW的速度。如图2e所示  ,该预测与我们的实验结果吻合良好。此外,该数学模型还表明,SOTR可以维持的最大ReWs随环直径的增加而增加,这一点已通过实验得到证实(图  2f)。在此,数学模型预测直径为17 mm的SOTR可能包含多达19个ReW。通过实验,我们发现具有3mm立柱的SOTR基于其发生ReW的次数最高(≥1 ReW时约为90%)是最佳的(补充图  9),这可能是由于SOTR的被动拉伸导致的。不同的立柱直径及其对各向异性结构组织的影响。而且,一个ReW的跳动频率仅比柱长为1mm的SOTR慢。因此,选择了3毫米立柱的SOTR进行后续研究。

ReW与心肌细胞的成熟有关

人类的胎儿心率有所变化,尽管通常稳定在〜3 Hz,而成年人的心率约为1 Hz 39电刺激已被用来使心肌细胞以相对于正常人的频率高于正常频率的速度起搏,从而使心肌成熟3但是,持续不断的高电刺激会导致细胞损伤。在这里,SOTR中的ReW能够在没有外部刺激的情况下使心肌细胞以各种频率跳动。

我们使用RNA测序来比较不同组之间的基因表达谱。主成分分析(PCA;图  3a)和Spearman相关性结果的层次聚类(图  3b)显示,与未进行ReW训练的人相比,接受ReW训练的hiPSC来源的心肌细胞之间具有更紧密的相关性。此外,我们在零,一个和两个ReW组中发现了不同的基因表达模式(图  3c)。根据基因本体论(GO)分析的功能注释显示,上调的基因(调整后的P <0.05;与没有ReW的SOTR相比,具有两个ReW的SOTR的倍数变化> 1.5)与对未折叠蛋白的反应和许多与成熟相关的术语有关。GO富集的大多数术语与心脏发育有关,包括肌肉结构发育,细胞外结构组织,肌动蛋白丝基化过程,组织形态发生和肌肉系统过程。对未折叠蛋白的反应是缓解或消除由缺氧引起的内质网(ER)应激的应对反应40,这可能是由于SOW与ReW的高频跳动所致。为了验证这些发现,我们进行了免疫染色和定量聚合酶链反应(qPCR)分析。与零ReW组中观察到的水平相比,对具有一和两个ReW的SOTR内的心脏特异性标志物进行的免疫染色清楚地揭示了与收缩速度相关的心脏成熟标志物-β-肌球蛋白重链(β-MHC)的更高表达(图。  图3e中,f)。此外,对信使RNA(mRNA)表达的分析揭示了许多上调的基因,包括MYH7(编码β-MHC)和与肌节结构有关的基因(ACTN2DES),心室结构有关的基因MYL2MYL3)),ER-Ca 2+功能(PLN),肌红蛋白(MB)和β1-肾上腺素能受体(ADRB1)。与那些具有零REW(图比较了REWS SOTRs具有更高倍上调的基因  3E-G 由于较高的打浆速率培养过程中,其与利用电刺激在不同的频率先前的报告一致阱316

图3:ReW与心脏特异性基因表达的上调相关。
图3

基于RNA测序数据的带或不带ReW的SOTR  PCA。b热图,显示了通过比较每个样本的表达值得到的相关矩阵的层次聚类。使用Spearman相关性计算的相关性。c热图显示具有ReW(1和2 ReW)的SOTR的349个基因与具有零ReW的SOTR 的相对表达水平(z得分)。与具有零ReW的SOTR相比,具有两个ReW的SOTR中上调的基因显着丰富了d GO类别。分析倍数变化> 1.5且P  <0.05的基因列出了丰富的术语。Ë第14天具有零,一或两个ReW的SOTR的代表性共聚焦图像。心肌细胞用抗β-MHC(红色)和DAPI(蓝色)染色。比例尺代表50 µm。f第14天对SOTR中β-MHC水平进行定量,将从共聚焦成像获得的β-MHC的总积分荧光归一化为ReW为零的SOTR(均值±sd;n  = 4个生物学独立的样品)。** P  <0.01(方差分析)。g细胞接种后14天,SOTR中心脏特异性基因(qPCR)的表达(平均值±标准差;n  = 4个生物学独立的样品)。P  <0.05;** P  <0.01;*** P  <0.001(方差分析)。

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当将SOTR心肌细胞的RNA序列数据与成年心脏细胞和hiPSC来源的心肌细胞的RNA序列数据进行比较以前的报道41)(补充图  10)时,SOTR心肌细胞显示出较低的结节(TBX18SHOX2MSX2TBX2HCN1HCN4)和心房相关(MYH6NPPA)和更高心室相关的(MYL2比以前报道的心肌细胞)的基因表达41先前研究的SOTR心肌细胞和心肌细胞均显示出MYH7MYL2,但IRX4表达高于成年心肌细胞。另外,经过ReW训练后,两个ReW组的间隙连接(GJA1)和n-钙粘着蛋白(CDH2)高于零ReW组(补充图  1112)。

苏木精和曙红(HE)染色显示,具有ReW的心肌细胞与没有ReW的心肌细胞相比具有更高的密度(补充图  13)。此外,具有ReWs的SOTRs沿环方向显示密集的心肌肌丝,也沿着ReWs的路径,而没有ReWs(0 ReW)的SOTRs中的心肌细胞是随机定向且组织不良的(图  4a,b)。另外,在14天的培养期之后,与没有ReW的SOTR相比,具有ReW的SOTR中的心肌细胞强烈表达α-肌动蛋白(图  4c),这与基因表达结果一致(ACTN2,图  3g)。)。重要的是,具有ReW的SOTR中的心肌细胞的肌节长度明显长于没有ReW的心肌(1 ReW:1.71±0.08 µm; 2 ReW:1.83±0.10 µm; 0 ReW:1.49±0.08 µm; 1 ReW vs. 0 ReW:p  = 0.012; 2 ReW与0 ReW:p  = 0.001)(图  4c,d),它更接近成人成年心肌细胞的肌节长度42此外,在第2天,有或没有ReW的SOTR均显示出随机分布且组织不良的心肌细胞,并且成熟水平相似(补充图  4)。在第14天通过快速电刺激也可以在零ReW SOTR中诱发ReW(补充电影  6)。总的来说,这些数据以及前一天的14结果表明,ReW起搏与成熟度提高相关。

图4:ReW与心肌细胞排列有关。
图4

具有零,一或两个ReW的SOTR 代表性共焦图像。心肌细胞用抗TnT2(红色)和DAPI(蓝色)染色,在第14天显示ReW样品中的心肌细胞排列。箭头标记了环的方向,在每个共聚焦图像中放大了绿色虚线框所界定的区域。比例尺代表50 µm。b基于TnT2方向分布的傅立叶分量分析的角度图。c具有不同ReW的染色SOTR的代表性共聚焦图像(红色:α-肌动蛋白;蓝色:DAPI)。箭头标记了第14天的环方向。比例尺代表30 µm。d第14 天, SOTR内心肌细胞的肌节长度[平均±sd;0 ReW(n  = 5); 1倒数(n = 5); 2个ReW(n  = 4个生物学独立的样本)。P  <0.05;** P  <0.01(方差分析)。È SOTRs的第14天。比例尺上TEM分析表示1微米。

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此外,电子显微镜检查表明,ReW组中的细胞表现出较大的肌节束,清晰的Z盘,A带和肌原纤维(图  4e)。这些数据表明,与具有零ReW的那些相比,具有ReW的SOTR内的心肌细胞成熟得到了改善。我们的发现证实了具有ReW的SOTR的遗传和结构成熟。

ReWs与改善的Ca 2+处理性能相关

细胞外通量分析仪用于表征SOTRs内心肌细胞的线粒体功能。为了记录来自三磷酸腺苷(ATP)合成的电子传输链的最大活性,线粒体ATP合酶被寡霉素抑制,并添加了质子梯度放电器以测量最大的线粒体呼吸作用。我们的结果表明,具有两个ReW的组的最大呼吸速率显着高于具有零或一个ReW的组所观察到的最大呼吸速率(图  5a,b; 2个ReW与1个ReW:p  = 0.0075; 2个ReW与0个ReW :p  = 0.001),表明较高的ReW导致线粒体活性增加。

图5:ReW与增强的Ca 2+处理特性相关。
图5

a耗氧率(OCR)分析的结果。寡聚寡核苷酸; FCCP,羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯hydr;ROTE / ANTI,鱼藤酮和抗霉素A. b的最大呼吸容量的定量(平均值±SD; ñ  = 4个独立生物样品)。** P  <0.01(方差分析)。Ç的Ca代表性迹线2+瞬变以下具有零REW,一个REW,并在一天两个REWS 7. SOTRs浸入室温介质停止REWS第6天的5mM咖啡因施用到心肌细胞在SOTRs d咖啡因诱导不同组中峰强度的变化(平均值±标准偏差;n  = 6个生物学独立的样品)。*P  <0.05(方差分析)。e在逐步拉伸过程中强制使用SOTR痕迹。f SOTR的最大收缩力(平均值±sd;n  = 3个生物学独立的样品)。P  <0.05(单尾学生t检验)。

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因为人类心肌细胞依赖于来自肌质网(SR)的Ca 2+流入而收缩,所以我们通过将咖啡因应用于SOTRs来研究SR功能,以打开SR ryanodine通道3尽管所有组均对添加5 mM咖啡因有反应(图  5c,d),但具有两个ReW的SOTR的强度变化明显高于具有零ReW的组,表明Ca 2+处理性能的成熟度更高p  = 0.0237)。此外,我们使用机械测试仪记录了SOTR的收缩力(图  5e,f和补充图  14),这表明零或两个ReW的SOTR产生的主动力随着施加的拉伸力而增加,呈Frank-Starling状43此外,具有两个ReW的组所产生的力大于具有零ReW的组中的力(2个ReW:0.54±0.15mN mm -2; 0ReW:0.23±0.12mN mm -2)。

讨论区

兴奋收缩耦合对心肌细胞的发育和功能至关重要44,跳动率可能在心脏成熟中起重要作用。人类胎儿心跳从大约1到子宫内9周内〜3赫兹胚胎发育过程中线性地增大4546hiPSC衍生的心肌细胞在功能和形态上类似于胎儿心肌细胞;然而,hiPSC衍生的心肌细胞的平均跳动率远低于人类胎儿心肌细胞。先前的研究通过增加其跳动率来促进心肌细胞的成熟。然而,hiPSC来源的心肌细胞的高节拍速率只能通过施加高频电刺激达到31416,使得这种刺激的可持续应用大发3d上的挑战。此外,电刺激可能会引起潜在的副作用,包括pH值变化,ROS生成,电解20和细胞损伤18

在本研究中,我们创建了具有自发产生的ReW的SOTR,这些ReW能够在没有外部刺激的情况下持续引起心肌细胞以高频率(高达4 Hz)跳动。我们发现具有ReWs的心肌细胞以频率依赖的方式表现出显着改善的结构成熟,增强的心脏基因表达和Ca 2+处理特性。由于这种活动也可能导致SOTR缺氧,因此将来在SOTR培养期间可以利用增强的氧气供应,例如动态培养5所提供的氧气此外,虽然通过REWS训练心肌细胞仍然不太成熟比状态的最先进的方法产生的那些111447,通过更改刺激窗口/持续时间和提高拍打频率,可以进一步影响ReWs组的成熟水平。

通过使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具和市售Petri皿的一步法,无凝胶法形成SOTR。需要SOTR形成<2天后,这是一个周期比以前报道的组织环的形成时间(〜7-14天)短得多的224849,由于多种因素,包括使用无凝胶的介质中,且低培养皿的附着表面,以及心肌细胞聚集为3D结构的能力。这种方法可能是目前广泛使用的方法的一个重要补充3202226,并且不使用任何外源性ECM(例如胶原蛋白或血纤蛋白)而迅速形成组织环的方法,可能会为将来大规模生产成熟组织用于药物筛选和再生应用提供新的见解50

鉴于在一口井中形成SOTR所需的大细胞数量(4×10 5个细胞),仍然难以实现与先前研究相当的高通量评估,在先前的研究中,每百万个心脏细胞创建了200个组织构建体51需要进一步优化以按比例缩小PDMS模具并减少电镀的电池数量。此外,由于力产生是心肌细胞的主要功能,力的量化最近已经用来评估药物有关的影响5152 ; 因此,将来用于SOTR成型的模具设计可能包括力传感器53,例如弹性硅胶柱,能够提供多个参数,以更相关地评估对药理学药物的反应。此外,由于电起搏可以与不同负载水平来控制(通过逐渐增加或减小的频率,或通过开/关的刺激的区域中随时间调整)1451,这将是开发具有可控刺激SOTRs有用。具有可控硅树脂柱的SOTR可用于实时调节ReW的频率。

对于再生应用54,例如注射到或植入50到梗塞的心脏中,心肌细胞成熟的程度是必要的还是一个悬而未决的问题在不同的ReW训练水平下,SOTR的各种成熟水平可能会提供预处理的心肌细胞,以输送到梗塞的心肌中,从而可以研究心肌细胞成熟如何影响治疗效果。

ReW训练的心肌细胞的跳动频率和肌节长度不随培养时间(> 89天)超过14天而增加(补充图  6)。这表明,快速起搏的成熟过程可能会限制在特定的时间范围内,类似于先前报告的发现14而且,由于可以通过改变SOTR直径来调整SOTR内ReW的频率,并且考虑到ReW可以维持> 89天,因此可以制造出具有可调节搏动率的起搏器组织,以用作用于药物评估或可能用于体内心脏起搏的体外模型。

总之,我们发现ReWs可以自发产生并维持在包含hiPSC来源的心肌细胞的SOTR中,并且ReWs能够使心肌细胞以与子宫发育过程中子宫内发现的频率相当的高频率跳动。此外,ReW与心肌细胞的结构和功能成熟有关,从而为电刺激细胞类型的基于电刺激的成熟提供了补充方法。

方法

hiPSC来源的心肌细胞的分化和培养

GCaMP3阳性的hiPSC(253G1)根据先前公开的方法培养和分化的5556所有涉及使用hiPSC的实验均遵循京都大学和大阪大学的指导原则进行。经过30〜50天的分化的心肌细胞集落漂浮在培养基中收集并通过在蛋白酶溶液[0.1%I型胶原酶,0.25%胰蛋白酶,1U毫升搅拌1和2小时之间解离成单细胞悬浮液- 1 DNA酶I,116毫的NaCl,20mM的HEPES,12.5毫的NaH 2 PO 4,5.6mM葡萄糖,5.4毫摩尔KCl和0.8mM的硫酸镁4(pH为7.35)] 56通过流式细胞术表征心肌细胞的纯度,并使用高纯度(> 85%)的心肌细胞进行以下实验。

大发3d制造

使用组织穿孔机(Thermo Fisher Scientific,沃尔瑟姆,美国马萨诸塞州,美国)将PDMS(SYLGARD 184;道康宁公司,美国密歇根州,密歇根州)打孔至内径为8 mm。移除多余的中央支柱后,收集剩余的PDMS孔,将PDMS孔和直径不同的支柱进行中心对齐,并按如下方式连接到24孔超低附着板(Corning,Corning,NY,USA)的底部补充图  1c所示对于微电极阵列(MEA; Multi Channel Systems,Reutlingen,Germany)记录,使用硅酮胶(Shin-Etsu Chemical,Tokyo,Japan)将PDMS井和柱安装到MEA表面,以将井和柱固定到井底。干燥并用紫外线处理30分钟后,PDMS孔即可进行心肌细胞培养。

SOTR代

在细胞接种之前,使用40 µm细胞过滤器(BD Falcon; Becton Dickenson,Franklin Lakes,NJ,美国)过滤单个心肌细胞,并以2×10 6个细胞mL -1的密度重悬在含有40%细胞的培养基中。高葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich),40%IMDM(Iscove改良的Dulbecco培养基; Sigma-Aldrich),20%胎牛血清(FBS; Gibco,USA),最低1%的非必需基本培养基氨基酸溶液(Sigma-Aldrich),0.1%青霉素-链霉素(Gibco)和0.5%1-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)。然后,在每个带有3毫米立柱的PDMS培养孔中接种4×10 5个细胞。对于其他直径的孔,孔数固定为4×10 5或与直径成正比的像元数。铺板后,心肌细胞在孔中沉降,聚集并聚集在中心柱周围,在2天内形成密集堆积的组织环。从第2天开始,将培养基更换为无血清培养基(不含FBS的培养基)。此后,每4天更换一次新鲜培养基。在更换培养基之前,将新鲜培养基预热至37°C。在更换培养基期间,将碟子放在预热的金属块上。将培养基缓慢且缓慢地移入孔中。为了进行动态培养,将培养皿在培养箱中安装在旋转振荡器上(NA-M301,Nissin,日本),以26rpm的速度旋转。除非另有说明,否则本研究中的所有数据均在静态培养条件下收集14天。

光学测绘和测量

使用配备有电荷耦合器件(CCD)相机(Exiblue;加拿大不列颠哥伦比亚省萨里市Qimaging或DP74; Olympus)的荧光显微镜(Olympus IX71; Olympus,日本东京)观察组织组装的进展。GCaMP3在450至490 nm范围内激发,并在30帧s -1下用CCD像素的8×8像素合并记录GCaMP3阳性心肌细胞的荧光图像使用ImageJ(NIH,Bethesda,MD,美国)和MATLAB(R2014b; MathWorks,Natick,MA,美国)使用定制程序对图像进行处理以获得数据。激活时间映射是使用ImageJ中的自定义插件执行的,如前所述57简要地说,对每个帧应用2像素半径的高斯空间卷积。随后,对时间序列数据进行时间低通滤波以降低噪声,检测细胞激活的上冲,并针对每个像素独立地计算后续激活之间的线性激活图。

电压敏感染料染色

根据制造商的规程(FluoVolt TM,Thermo Fisher Scientific)进行电压染料染色。在50 µL PowerLoad中稀释5微升FluoVolt TM染料,然后将其悬浮于5 mL预热至37°C的高葡萄糖DMEM(Sigma-Aldrich)中。然后,将200 µL染料溶液施加到含有SOTR的孔中15分钟。除去染料溶液后,将组织用DMEM洗涤两次。

瞬态和电生理Ca 2+表征

Ca 2+瞬变通过GCaMP3阳性心肌细胞的荧光成像记录,其实验设置与光学映射和测量所描述的相同。为了表征SOTR的自发跳动,在记录前1天通过在室温下将SOTR放入培养基中1分钟,从SOTR上去除ReW。如图所示,将5 mM咖啡因(和光纯药工业有限公司,日本大阪)直接添加到装有SOTR的腔室中。

使用MEA数据采集系统(USB-ME64;多通道系统)进行场电势(FPs)的细胞外记录。心肌细胞接种后第5天和第6天记录信号,并使用MC_Rack(多通道系统)或LabChart(ADInstruments,但尼丁,新西兰)收集和处理数据。通过分析FP的波形来确定振幅,QT间隔和拍频。

组织学

SOTRs用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗3次,固定在PBS中的4%多聚甲醛(PFA)中30分钟,然后包埋在石蜡中。将薄片切成薄片并用HE(Muto Chemical Corporation,东京,日本)染色,并使用CKX41显微镜(Olympus)进行观察。

免疫染色和成像

将SOTR在室温下固定在4%PFA中30分钟,在室温下用0.5%(v / v)Triton X-100在Dulbecco's(D)-PBS中透化1 h,并在封闭液中孵育[0.1%( v / v)在4°C下于D-PBS中加入Tween-20、5%(v / v)正常驴血清,3%(v / v)牛血清白蛋白和5%(v / v)正常山羊血清)持续16小时。然后将SOTR与一抗抗肌钙蛋白T2(TnT2;小鼠单克隆IgG; 1:200; SC-20025; Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA),抗α-肌动蛋白(小鼠单克隆IgG,1: 1000; A7811; Sigma-Aldrich)或抗β-MHC(小鼠MYH7单克隆IgM,1:100; SC-53089; 圣克鲁斯生物大发3d)在4°C下过夜。然后用PBS冲洗SOTR,并与在封闭缓冲液中以1:300稀释的二抗孵育(Alexa Fluor 594抗小鼠IgG; 715-586-150;和DyLight-594抗小鼠IgM; 715-516-020; Jackson ImmnoResearch (美国宾夕法尼亚州西格罗夫)在室温下放置1小时。使用4'-6-Diamidino-2-phenylindole(DAPI; 300 nM; Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)在室温下对细胞核进行染色30分钟,然后使用共聚焦显微镜(FV1200; Olympus)捕获图像。使用ImageJ 46中的傅立叶分量分析插件“ Directionality”确定SOTR中的心肌细胞方向(NIH)计算了红色通道的方向分布。β-MHC的荧光定量通过计算所有样品组的平均面积灰度值进行,所有荧光值均归一化为零ReW组。

透射电子显微镜(TEM)

SOTR用0.1 M的Sorenson缓冲液(pH 7.4)洗涤两次并用2.5%的戊二醛(Sigma-Aldrich)固定在0.1 M的Sorenson缓冲液(pH 7.4)中,然后将样品用1%的OsO 4固定在Sorrenson的缓冲液中。然后将样品包埋,切片并用柠檬酸铅染色,并在JEOL1010透射电子显微镜(日本东京的JEOL Ltd.)下检查。

线粒体呼吸测定

使用Seahorse XF96细胞外通量分析仪(Agilent Technologies,卡尔斯巴德,加利福尼亚州,美国)分析线粒体功能。培养14天后,将SOTRs通过在蛋白酶溶液中搅拌30分钟而解离为单细胞悬液,然后将细胞以每XF96孔20,000个细胞的密度接种到细胞培养微孔板(Agilent Technologies)上。接种后3天进行OCR测定,并将培养基更换为基础培养基(补充有1mM丙酮酸钠的Seahorse XF测定培养基; Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)。在测量过程中以3.5μM4-(三氟甲氧基)苯hydr(FCCP; Seahorse Bioscience,Billerica,MA,USA)的终浓度注射底物和抑制剂,用于MitoStress分析的终浓度为1μM寡霉素,0.5μM抗霉素和0.5μM鱼藤酮。

流式细胞仪

在用于产生SOTR之前,将hiPSC衍生的心肌细胞在室温下于4%PFA中固定30分钟,在室温下用0.5%v / v Triton X-100在Dulbecco's(D)-PBS中透化30分钟,然后孵育在37°C下用抗TnT2抗体(小鼠单克隆IgG,1:200;圣克鲁斯生物大发3d:SC-20025)或同种型匹配的抗体(BD Phosphoflow:557782)在30°C孵育30分钟,用D-PBS洗涤,然后孵育用Alexa Fluor 488抗小鼠IgG(1:500; Jackson ImmnoResearch:715-546-150)。然后将细胞用D-PBS洗涤两次,并使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences,美国)和FlowJo软件(Treestar Inc.,美国)进行分析。显示的数据代表四个独立实验。

收缩力分析

SOTR收缩性是使用微米级的机械测试系统(MicroSquisher; CellScale生物材料测试,加拿大安大略省滑铁卢)测量的。在测量前1天,通过在室温下交换培养基来停止ReWs的操作,然后从柱子上取下SOTR并切成条状。然后,将条固定在台上,并浸入加热至37℃的培养基中。将直径为0.30毫米的悬臂梁压在SOTR上(补充图  14)。光束较低以将SOTR条带拉伸成不同的长度。在每个长度处,梁保持50 s,并通过悬臂梁的挠度响应微分位移来计算力。

定量聚合酶链反应

根据制造商的说明,使用Trizol试剂(Life Technologies)收集SOTR中的总RNA,并使用NanoDrop1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)确定RNA浓度。使用First-strand合成试剂盒(TaKaRa,Shiga,Japan)合成互补DNA(cDNA),并使用SYBR Green PCR主混合物(Life Technologies)和qBiomarker验证PCR阵列(IPHS-102A; Qiagen,Hilden,德国)按照制造商的说明以96孔格式进行。循环条件设定如下:在95°C初始变性10分钟,然后在95°C进行40循环15 s,在60°C进行70 s。反应在StepOnePlus实时PCR系统(Life Technologies)中进行。使用2 −∆∆Ct确定基因表达方法和相对于3-磷酸甘油醛脱氢酶的表达有关。热图由“ pheatmap”包(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html)创建,并且使用Ward.D聚类算法(https:// stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/hclust.html)。

RNA定量和RNA测序鉴定

在1%琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染。使用NanoPhotometer分光光度计(Implen,Westlake Village,CA,USA)测定RNA纯度。使用Qubit 2.0荧光计(Life Technologies)中的Qubit RNA分析试剂盒测量RNA浓度。使用RNA Nano 6000分析试剂盒和Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies)评估RNA完整性。

RNA测序的文库制备

每个样品总共1.5μgRNA用作RNA样品制备的输入材料。成人正常心脏RNA购自BioChain(美国)。使用NEBNext UltraTM RNA文库制备试剂盒Illumina(New England Biolabs,Ipswich,MA,USA)根据制造商的说明生成测序文库,并将索引代码添加到每个样品的属性序列中。简而言之,使用附着有poly-T oligo的磁珠从总RNA中纯化mRNA,并使用二价阳离子在升高的温度下于NEBNext First-Strand Synthesis反应缓冲液(5x; New England Biolabs)中进行片段化。使用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNase H-; New England Biolabs)合成第一链cDNA。随后使用DNA聚合酶I和RNase H进行第二链cDNA合成。剩余的突出端通过核酸外切酶/聚合酶活性转化为平末端。DNA片段的3'末端进行腺苷酸化后,将具有发夹环结构的NEBNext Adapter(New England Biolabs)连接起来以进行杂交。为了选择正确长度的cDNA片段,使用AMPure XP系统(Beckman Coulter,美国加利福尼亚州贝弗利市)纯化文库片段,然后将3 µL USER酶(New England Biolabs)与大小选择的衔接子一起温育。在37°C下连接cDNA 15分钟,然后在95°C下5分钟。使用Phusion高保真DNA聚合酶,通用PCR引物和Index(X)引物(New England Biolabs)进行PCR。纯化产物(AMPure XP; Beckman Coulter),并使用Agilent Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies)评估文库质量。

聚类和排序

根据制造商的说明,使用HiSeq 4000 PE群集试剂盒(Illumia,圣地亚哥,加利福尼亚,美国)在cBot群集生成系统上对索引编码的样本进行群集。产生簇后,将文库制备物在Illumina Hiseq 4000平台(Illumina)上测序,并产生150 bp的配对末端读数。

在质量控制后,使用TopHat(v2.0.12; https://ccb.jhu.edu/software/将配对的末端读数与hg19人类参考基因组(UCSC; https://genome.ucsc.edu/)进行比对。tophat / index.shtml58我们将相对表达水平量化为log 2(FPKM +1),以执行PCA分析和层次聚类。由HTSeq 59计数的唯一映射的读数用于在DEseq2 60中进行差异表达分析总共选择了349个基因(P  <0.05,倍数变化> 1.5)进行GO分析。我们使用R中的“ pheatmap”包绘制了热图(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html),并使用Metascape 61http://metascape.org/进行了GO富集分析

统计和可重复性

所有定量数据均以平均值±平均值的标准偏差(平均值±sd)表示。实验组之间的差异通过单尾学生t检验(两组之间)或方差分析(方差单向分析)进行分析,然后通过图基事后检验(三组或更多组)进行分析。P  <0.05被认为是统计学显著。

报告摘要

链接到本文的《自然研究报告摘要》中提供了有关研究设计的更多信息  


(来源: 世联博研(北京)科技有限公司


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